RU EN

Камеры для получения изображений живых клеток (I)

Благодаря растущему числу исследований, использующих методы визуализации живых клеток, и стремительным успехам в области технологии флуоресцентных белков и синтетических флуорофоров, складывается принципиальное понимание природы функционирования клеток и тканей. По существу, визуализация живых клеток стала не только необходимым инструментом в большинстве биологических лабораторий, занимающихся изучением клеток, но и стандартной методикой, применяющейся в различных областях нейробиологии, биологии развития, фармакологии и других биомедицинских дисциплинах.

Культуральные камеры для получения изображений живых клеток

Камеры для образцов — это неотъемлемая и очень важная часть истории получения изображений живых клеток. На протяжении многих лет в публикациях описываются многочисленные конструкции, обладающие превосходными оптическими характеристиками и, в то же время, позволяющие сохранять образцы в течение различных промежутков времени. Все культуральные камеры — от простого покровного стекла с препаратом, приклеенного герметиком к предметному стеклу микроскопа, до совершеннейших перфузионных камер, позволяющих строго контролировать практически все параметры окружающей среды, имеют одно общее предназначение — обеспечивать возможность наблюдать живые образцы с высоким разрешением и при минимальной степени вмешательства.

Рис. 1. Высокопроизводительный инкубатор/перфузионная культуральная камера

Чтобы камеры для получения изображений живых клеток можно было с успехом использовать для проведения экспериментов, они, независимо от конструкции, должны удовлетворять целому ряду различных требований. Прежде всего, с целью минимизации воздействия загрязняющих факторов, камера должна обеспечивать полную изоляцию образца от лабораторной окружающей среды в процессе эксперимента, а также легко стерилизоваться. С другой стороны, культуральная камера должна предоставлять сравнительно простой доступ к клеткам, если в ходе эксперимента необходимо делать микроинъекции, добавлять реагенты (например, лекарственные препараты или метаболиты), выполнять физические манипуляции с клетками или менять культуральную среду. В тех случаях, когда эксперимент сопровождается клонированием или связыванием и окрашиванием культуры синтетическими флуорофорами, либо за счет иммунофлюоресценции после сеанса съемки, конструкция камеры должна допускать извлечение покровного стекла.

Размеры культуральной камеры, в том числе габаритные, а также площадь поверхности для клеточной культуры и объем среды (или буфера), в которую погружаются клетки, являются весьма важными параметрами. Кроме простоты установки на предметном столике микроскопа, культуральная камера должна иметь достаточно большие горизонтальные размеры, чтобы вмещать, достаточное для выборки необходимой популяции, количество клеток. С целью достижения максимально возможного оптического качества при прохождении света через среду, а также для обеспечения доступа к клеткам, глубина окружающей среды должна быть минимальной, в то же время, для обеспечения здорового окружения, она должна быть достаточно большой. Следует избегать использования пластиковых покровных стекол из-за присущей им автофлуоресценции и двойного лучепреломления, создающих интерференционные помехи в некоторых режимах получения изображений. Лучше всего использовать стеклянные покровные стекла высшего качества, которые необходимо чистить концентрированной кислотой или щелочью и тщательно промывать. Имеющиеся на рынке культуральные камеры различаются по надежности, универсальности и стоимости. Эти факторы следует учитывать при разработке экспериментов, чтобы определить, что же требуется — одна сложная (и, часто, дорогая) камера, или много простых чашек для культивирования. В конечном счете, следует признать, что совершенная культуральная камера для всех применений не существует, а для достижения успеха в получении изображений живых клеток часто необходим целый ряд компромиссов.

На рисунке 1 представлены две серийно выпускающиеся высокоэффективные (инкубационная и перфузионная) камеры для получения изображений живых клеток. Камера открытого типа (рисунок 1(a)) предназначена для использования с 35-миллиметровыми чашками Петри с приклеенным к днищу покровным стеклом, и оснащена термоэлектрическим тепловым насосом, позволяющим регулировать температуру в диапазоне от -5 до +50 градусов Цельсия. Многочисленные варианты перфузионных систем позволяют осуществлять непрерывную перфузию при постоянной температуре, периодическую перфузию, статистическую инкубацию культуральной среды (без перфузии), или использовать перфузию для быстрого изменения температуры среды. Высота жидкости в камере регулируется винтовым механизмом, соединенным со всасывающим портом (отверстием), что исключает колебания жидкости в процессе замены среды. Кроме того, камера оборудована одноканальной системой фиксации потенциала — пэтч-кламп, соединенной с покрытой тефлоном ячейкой, в которой установлен хлорсеребряный электрод для формирования соляного мостика при исследованиях проницаемости ионных каналов в электрофизиологии, требующих низкого уровня помех. Поток газа над верхней частью камеры повышает равномерность температуры и облегчает контроль pH. Представленная на рисунке 1(b) закрытая камера оснащена уникальной перфузионной системой двойного назначения, в которой ламинарное течение создается управляемым потоком среды через специальное предметное стекло с каналом (микроакведуком), покрытое тонкой прозрачной электропроводящей пленкой из оксида индия и олова, предназначенной для регулирования температуры. Эта система может работать при скоростях потока от нуля (статическое состояние) до быстрой смены среды, в диапазоне температур окружающей среды до 50 градусов Цельсия, с минимальным поверхностным смещением клеток. Камера совместима как с бикарбонатными, так и с органическими буферами, и имеет интерфейс для автономного устройства управления.

Историческая перспектива

Первые камеры для получения изображений живых клеток были созданы в начале двадцатого столетия, вскоре после разработки методик выращивания клеточных культур млекопитающих. Для контроля потока среды через стеклянные сосуды или пробковый корпус со стеклянными окнами, в большинстве камер ранних конструкций использовался фитиль. С течением времени был создан ряд камер искусственного климата перфузионного типа, для использования в длительных экспериментах по получению изображений с помощью имевшихся в то время оптических микроскопов. В 50-е и 60-е годы двадцатого столетия были созданы более совершенные камеры для получения изображений живых клеток, предназначенные для проведения исследований с высоким разрешением, что стало возможным благодаря появлению методов фазового и дифференциально-интерференционного контраста (ДИК) в микроскопии. После того, как в конце 1960-х — начале 1970-х годов были усовершенствованы рабочие методики и средства сопряжения пленочных кинокамер с микроскопами, исследователи получили возможность проводить систематические эксперименты с получением изображений живых клеток в заданные интервалы времени, с высоким пространственным и временным разрешением, при помощи существенно более сложных камер.

Рис. 2. Конструкции ранних перфузионных камер для визуализации живых клеток

Разработанные в 1970-е и 1980-е годы камеры для получения изображений базировались на стандартной слоеной конструкции из двух покровных стекол, разделенных парой уплотнительных колец или аналогичных прокладок, и установленных в держатель, состоящий из двух металлических пластин. Эта конструкция, имевшая целый ряд ошибок, включая невозможность менять культуральную среду и добавлять отмеренные количества лекарственных препаратов или метаболитов, доминировала в течение многих лет. В конце концов, путем модификации этой конструкции были созданы более современные перфузионные камеры, позволяющие непрерывно добавлять свежую культуральную среду и периодически — другие реагенты. Многие из таких ранних камер страдали одним серьезным недостатком, а именно, недостаточно ламинарным течением, когда за счет плавного перехода при замене среды минимизируется формирование химических градиентов. Ламинарный поток гарантирует, что в процессе замены два раствора не будут смешиваться турбулентно, что и позволяет избежать формирования упомянутых химических градиентов. В результате постоянного совершенствования, как простых, так и сложных камер для получения изображений, в течение нескольких последних лет были созданы превосходные конструкции, удовлетворяющие требованиям большинства методов получения изображений.

На рисунке 2 показаны некоторые, из созданных в конце 20-го века, камер для получения изображений живых клеток. Различные варианты таких камер имеются на рынке, а во многих лабораториях создан ряд производных конструкций. Камера, показанная на рисунке 2(a), представляет собой версию второго поколения камеры, изначально сконструированной Дэем Алленом (Day Allen) и Эндрю Байером (Andrew Bajer), и предназначена для использования в экспериментах с перфузией и прямыми микроскопами. Выходной канал большого диаметра снижает вероятность растрескивания покровного стекла. Камера легко адаптируется под инвертированный микроскоп для наблюдения тканевых культур. Будучи сравнительно дешевой в создании, эта камера, все же, не обеспечивает идеально ламинарный поток. На рисунке 2(b) показана камера конструкции Дворжака-Стотлера (Dvorak-Stotler) с круглыми покровными стеклами и прокладками, в разное время выпускавшаяся некоторыми производителями, и также довольно простая в конструировании. При скорости перфузии 1 миллилитр в час, камера Дворжака-Стотлера создает чистый, равномерно распределенный поток на поверхности покровного стекла. На рисунке 2© представлен пространственный чертеж сложной перфузионной камеры, созданной в начале 1950-х годов, которая первоначально изготавливалась путем фрезерования из полированного плексигласа. Позволяя с высоким разрешением наблюдать образцы при непрерывной перфузии, эта конструкция не обеспечивает удовлетворительную ламинарность. На рисунке 2 представлена лишь очень малая часть того множества конструкций, которые были описаны в литературе за последние 50 лет.

Сегодня на рынке представлен широчайший спектр камер для получения изображений живых клеток, — от простых конструкций для установки на предметном стекле микроскопа до сложнейших систем, позволяющих контролировать практически все параметры окружающей среды. Хотя многие исследователи (в особенности те, кто имеет возможность пользоваться механическими мастерскими) продолжают изготавливать специализированные камеры для своих конкретных экспериментов, сегодня на рынке предлагается по умеренной цене широкий ассортимент камер заводского изготовления, имеющих полимерную конструкцию, обеспечивающих ламинарный поток и высокое разрешение, использующих ряд недорогих одноразовых инструментов. Как уже подчеркивалось, самым важным качеством любой культуральной камеры является гарантия и обеспечение жизнеспособности и нормального роста клеточных культур в стандартных временных рамках. Кроме того, камера должна иметь оптическое окно для микроскопа, обеспечивающее получение изображений культуры, при числовых апертурах, достаточных и соответствующих требованиям к разрешающей способности при проведении исследований.

Простые камеры для получения изображений на базе предметного стекла и чашки Петри

Краткосрочные (20–30 минут и менее) эксперименты с получением изображений можно проводить путем простого помещения покровного стекла, содержащего адгезивные клетки, на предметное стекло микроскопа с использованием разделителей, предотвращающих повреждение клеток (в клетках некоторых линий физический стресс может вызвать автофлуоресценцию). Для обеспечения водонепроницаемости и предотвращения испарения культуральной среды покровное стекло можно закрепить любым из многочисленных герметиков (см. рисунок 3(a)), включая расплавленную агарозу, резиновый клей, вакуумную смазку или удобный препарат под названием VALAP (смесь 1:1:1 вазелина, ланолина и парафина). В качестве разделителей, предотвращающих непосредственный контакт клеток с предметным стеклом микроскопа, можно использовать прокладку, вырезанную из силиконового каучука (имеются, также, и на рынке), либо кусочки битого покровного стекла (рисунок 3(b)). Собирая такую камеру, необходимо убедиться в том, что покровное стекло установлено на разделительную прокладку (прокладки) стороной с клетками вниз. Промежуток между покровным и предметным стеклами заполняется физиологическим буфером (например, физиологический раствор с фосфатным буфером, PBS), либо питательным раствором для тканевой культуры. Края покровного стекла герметизируются предпочтительным реагентом, после чего предметное стекло помещается на предметный столик микроскопа для наблюдения. В отсутствие среды для выращивания и контроля температуры клетки могут нормально функционировать в течение всего лишь нескольких минут, однако, зачастую, этого времени достаточно для получения требуемых изображений. Для кратковременного хранения между исследованиями, без нарушения жизнеспособности клеток, предметное стекло можно поместить в углекислотный инкубатор, либо на небольшой обогреватель рядом с микроскопом. В качестве альтернативы, позволяющей избежать потери буферного раствора или культуральной среды в процессе хранения между экспериментами, предметное стекло можно поместить в небольшую обогреваемую камеру влажности.

Рис. 3. Культуральные и визуализационные камеры на предметных стеклах микроскопа

Синтетические уплотнительные кольца (рисунок 3©) или круглые прокладки аналогичной формы (такие, как усилительные прокладки, использующиеся для трехкольцевого зажима) являются удобной альтернативой плоским силиконовым прокладкам (рисунок 3(b)), и легко герметизируются любой, из уже упоминавшихся, монтажных смесей. Во многих случаях круглые прокладки имеют толщину, достаточную для пополнения объема культуральной среды или буферного раствора до уровня погружения клеток и, таким образом, снижают риск повреждения клеток в процессе установки. Часто получение изображений клеток, тонких срезов тканей, эмбрионов или организмов мелких насекомых на покровных стеклах упрощается, когда более толстое предметное стекло с одной лункой заменяется стандартным предметным стеклом (рисунок 3(d)). Такие стекла, приблизительно, на 3 миллиметра толще стандартных предметных стекол толщиной 1 миллиметр, что позволяет сделать лунку в них более глубокой (2 миллиметра). Такая лунка вмещает больший объем буферного раствора или культуральной среды, чем слоистая конструкция из плоского предметного и покровного стекол и, подобно конструкции с уплотнительными кольцами, снижает сдавливание, способное повредить клетки в процессе сборки камеры. С другой стороны, толстая конструкция и изогнутые стенки несовместимы с методами получения изображений с высоким разрешением в режимах улучшения контрастности (фазовый контраст, ДИК и модуляционный контраст Хоффмана; HMC).

Однако, лунка не влияет на формирование флуоресцентных изображений при эпископическом освещении покровного стекла.

Описанные в предыдущих параграфах простые конструкции на основе предметного стекла микроскопа предназначены, в первую очередь, для использования с прямыми микроскопами, в которых изображение клеток получается через тонкое покровное, а не через толстое предметное стекло. В некоторых случаях, в частности, при использовании прочного клея, собранное предметное стекло можно перевернуть и наблюдать клетки в инвертированный микроскоп, не причинив им серьезный вред. Или же, при наличии сухого объектива с высокой разрешающей способностью, оснащенного коррекционным кольцом, изображение образца можно, как правило, получить через нижнюю поверхность предметного стекла, если объектив обладает коэффициентом коррекции аберраций, позволяющим компенсировать избыточную толщину (1 мм). Более универсальную конструкцию, пригодную как для прямых, так и для инвертированных микроскопов, можно собрать, просверлив в стеклянном или пластиковом предметном стекле отверстие диаметром 1 см и приклеив к одной из сторон покровное стекло лаком для ногтей, силиконовым герметиком или одним из современные клеев, которые можно приобрести у продавцов оборудования (см. рисунок 3(e)). Лунку камеры можно заполнить культуральной средой или буферным раствором и установить на верхнюю поверхность при помощи второго покровного стекла, содержащего адгезивные клетки, временно закрепленные препаратом VALAP. В том случае, когда покровное стекло поверх лунки установлено аккуратно и под ним нет захваченных пузырьков воздуха, между двумя покровными стеклами образуется оптически прозрачный канал. Захваченные пузырьки воздуха образуют мениск, который может искажать изображения, получаемые в режиме проходящего света. Такая конструкция оптимальна для использования с прямыми микроскопами. Альтернативная методика загрузки, более пригодная для инвертированных микроскопов, состоит в том, что клетки выращиваются на неподвижно присоединенном покровном стекле, а затем накрываются, вместе со средой для выращивания, вторым покровным стеклом, как описано ранее.

На рынке имеется широкий ассортимент культуральных камер, созданных на базе предметного стекла микроскопа, удовлетворяющих требованиям многих краткосрочных экспериментов по исследованию живых клеток. Диапазон сложности этих камер простирается от простых пластмассовых культуральных сосудов и многолуночных кювет, приклеенных к предметным стеклам микроскопов, до сложных комплексных систем, позволяющих выполнять перфузию, манипуляции, оценку потока и экспресс-анализы для нескольких отдельных культур (см. рисунки 3(f) — 3(i)). На рисунке 3(f) представлена так называемая «лаборатория на предметном стекле» — многокамерная система, предлагаемая в различных конфигурациях — от одной большой камеры до нескольких (вплоть до 18) более мелких камер на одном предметном стекле (камера на рисунке 3(f) имеет 4 прямоугольные лунки). Эти универсальные автономные камеры снабжаются съемными, не препятствующими газообмену, пластмассовыми крышками, которые, однако, при получении изображений в режимах проходящего света могут создавать проблемы в виде мениска и двойного лучепреломления в пластике. Кроме того, если для получения изображений покровное стекло не помещается в камеру с контролем окружающей среды, то обеспечиваемый камерой газообмен может ограничивать время возможного нахождения клеток вне углекислотного инкубатора без воздействия на них повышенного уровня pH. Аналогичные камеры изготавливаются приклеиванием к 1-миллиметровому предметному стеклу или к 170-микронному покровному стеклу. Обе такие конструкции предназначены для визуализации выращиваемых клеток при помощи инвертированного микроскопа. В конце сеанса наблюдения живые клетки могут быть связаны и окрашены непосредственно в камере для выращивания, которую, затем, можно извлечь и установить на предметное или покровное стекло.

Показанная на рисунке 3(g) серийно выпускаемая камера для визуализации изображений объединяет в себе удобство культивирования клеток в чашке Петри с высоким оптическим качеством предметного стекла микроскопа и позволяет получать изображения с высоким разрешением в различных контрастных режимах. Два резервуара с культуральными средами соединяются предназначенным для наблюдения каналом емкостью 100 микролитров и шириной 5 миллиметров, что позволяет наблюдать большую клеточную популяцию. Поток в канале инициируется при заполнении одного из резервуаров. Раздваивающийся канал камеры, представленной на рисунке 3(h), предлагается на рынке как без покрытия, так и со специальными покрытиями для выращивания эндотелиальных клеток, с целью имитации кровеносных сосудов. Адаптеры люэровского типа по концам канала позволяют адаптировать камеру к перфузионной системе и прецизионно регулировать скорость потока и напряжение сдвига. Культуральные камеры такого типа — прекрасный пример специализированных конструкций, предназначенных для решения конкретных исследовательских задач. Представленная на рисунке 3(i) похожая камера предназначена для очень малых объемов (10 микролитров) при выполнении анализов дифференцировки стволовых клеток, а также для исследований по молекулярному распознаванию и связыванию, и для определения констант связывания на основе флуоресцентных изображений. Для увеличения эффективности, каждый из пяти каналов оборудован отдельным резервуаром для культуральной среды. В настоящее время рынок предлагает широкий ассортимент камер, многие из которых нацелены на экономию материалов и повышение эффективности выполнения конкретных исследований.

Рис. 4. Культуральные и визуализационные камеры на базе чашек Петри

Сегодня на рынке имеются чашки Петри различных конфигураций, предназначенные для получения изображений живых клеток в режиме высокого разрешения (см. рисунок 4). Самая простая и, возможно, самая универсальная конструкция состоит из стандартной одноразовой чашки Петри диаметром 35 мм или 50 мм, с круглым отверстием (10 мм, 14 мм или 20 мм) в центре крепежной поверхности; конструкция закрывается крышкой из высококачественного боросиликатного стекла, позволяющей с высоким разрешением наблюдать живые клетки (рисунок 4(a)). Камеры выпускаются как без покрытия, так и покрытые тонким слоем активатора склеивания, например, поли-D-лизина или коллагена. Известные под названием чашек со стеклянным дном, эти камеры выпускаются в вариантах с 6-ю, 12-ю и 24-мя лунками (рисунок 4©) для одновременного исследования нескольких культур. Аналогичная конструкция (рисунок 4(b)) состоит из специальной чашки Петри с большим круглым покровным стеклом, закрывающим все основание чашки. Такие чашки выпускаются в различных по размерам вариантах и могут снабжаться плотно притертыми крышками для сохранения атмосферы, в противоположность обычным чашкам Петри с неплотно пригнанными крышками для обеспечения газообмена. Хотя стандартные чашки Петри из полистирола и можно использовать для обычных наблюдений с низким разрешением (непосредственно через пластик), при помощи объективов с большим рабочим расстоянием и коррекционными кольцами, но для наблюдения через объективы с большой числовой апертурой (1,2 -1,4), в сочетании с водной или масляной иммерсией, требуются модифицированные чашки со стеклянным дном.

В большинстве случаев, культуральные камеры на базе чашек Петри заполняются значительно бóльшим объемом среды для выращивания или буферного раствора для получения изображений, нежели могут вместить камеры на базе предметного стекла, показанные на рисунке 3. Увеличенные объемы культуральной среды минимизируют опасность внезапных изменений температуры или кислотности (pH), и обеспечивают отличную среду для выращивания долгоживущих культур. Еще одним преимуществом таких камер является то, что вклеенное в днище чашки Петри покровное стекло позволяет с высоким разрешением получать изображения культивируемых клеток непосредственно после переноса их из инкубатора, а не после потенциально травмоопасной загрузки покровных стекол с посевом, или отделенных клеток, в специальную камеру для получения изображений. На практике, культуры, содержащие трансфецированные клетки млекопитающих (синтезирующие флуоресцентные белки), можно неоднократно переносить (для наблюдения или получения изображений) из увлажняемого углекислотного инкубатора на предметный столик микроскопа, и обратно, не причиняя серьезных повреждений клеткам. Кроме того, сегодня рынок предлагает постоянно расширяющуюся номенклатуру предметных столиков с обогревом и закрытых инкубаторов для микроскопии, предназначенных для сохранения 35 мм чашек Петри со стеклянным дном для долгосрочных последовательностей получения изображений в заданные интервалы времени.

Представленные на рисунках 3 и 4 простые камеры для получения изображений (по сути, предметные стекла и чашки Петри) можно неоднократно мыть, стерилизовать и повторно использовать. Сначала необходимо тщательно отмыть камеру моющим средством, затем тщательно прополоскать (промыть) деионизованной или дистиллированной водой и в течение нескольких дней сушить в пылезащищенном контейнере при комнатной температуре. Сильнее загрязненные камеры и предметные стекла, в особенности, подвергшиеся воздействию лекарственных препаратов, высохшей среды или клеточных адгезионных реагентов, можно предварительно замочить в этаноле или в разбавленной кислоте. Однако, такой обработке не следует подвергать камеры, в которых хрупкое покровное стекло приклеено к стеклу, металлу или пластмассе клеем либо другим клеящим составом на основе растворителя. После очистки и сушки камеры стерилизуются в автоклаве (не рекомендуется), либо ультрафиолетовой лампой в темном шкафу в течение 15 минут. В качестве экономичной и быстрой альтернативы, многие простые инкубационные камеры можно стерилизовать путем мытья этанолом и сушки в стерильном ламинарном боксе.

Хотя клеточные культуры, помещенные на покровные стекла или выращенные в чашках Петри со стеклянным дном, можно кратковременно (несколько минут) наблюдать на предметном столике микроскопа при комнатной температуре, сегодня рынок предлагает широкий выбор устройств, позволяющих использовать такие простые камеры для получения изображений в течение более длительных периодов времени. Носящие название обогревателей предметных столиков или инкубаторов, все эти устройства обеспечивают локальное регулирование температуры (см. рисунок 5), а более совершенные версии позволяют ограниченно контролировать атмосферу и осуществлять перфузию. Нагревательные плитки для стандартных предметных стекол микроскопов (1×3 дюйма; см. рисунки 5(a) и 5(b)) пригодны для регулирования температуры в камерах, представленных на рисунке 3, и легко адаптируются к большинству микроскопов, как правило, при помощи штатных зажимов. Представленный на рисунке 5(a) обогреватель столика оснащен металлической верхней пластиной, которая полностью закрывает предметное стекло микроскопа в обогреваемом отсеке. К сожалению, область покровного стекла с наблюдаемым образцом остается в открытом отверстии, и не обогревается. Проблема переноса тепла от предметного стекла к образцу осложняется использованием больших апертур, хотя, меньшие окна для просмотра, в свою очередь, зачастую создают дополнительные проблемы, препятствуя перемещению физически больших объективов с высокой числовой апертурой. Представленный на рисунке 5(b), обогреваемый держатель предметного стекла предназначен для адаптации к стандартному инвертированному микроскопу, и характеризуется меньшей апертурой, обеспечивая более равномерное распределение температуры по образцу, правда, за счет полезной площади зоны наблюдения.

Рис. 5. Обогреватели для чашек Петри и предметных стекол, инкубаторы

Одним из наиболее современных обогревателей является представленная на рисунке 5© многолуночная инкубаторная камера, предназначенная для точного контроля параметров окружающей среды (при использовании предметных стекол, аналогичных показанному на рисунке 5(f)), в том числе pH, температуры, перфузии и локальной атмосферы. В таком инкубаторе используются преимущества технологии термоэлектрического нагрева или охлаждения образца в диапазоне температур от 5 до 50 градусов Цельсия. Помимо того, к нему можно подсоединить до четырех перфузионных линий с регулируемой температурой, а также газовую систему охлаждения. Из многих уникальных качеств этого инкубатора следует особо отметить магнитное основание, позволяющее легко встраивать устройство в конфигурацию микроскопа, а также аспиратор, предназначенный специально для удаления перфузата с минимальным возмущением уровня жидкости. Все представленные на рисунках 5(a) — 5© подогреватели и инкубаторы оборудованы интерфейсом для подключения к отдельному устройству управления, с целью поддержания требуемых значений температуры и других необходимых параметров (например, путем перфузии и регулирования атмосферы).

Инкубаторы на базе чашек Петри (см. рисунки 5(d) — 5(f)) по конструкции и функциональным принципам аналогичны простым обогревателям предметных стекол микроскопов. Самый простой вариант, представленный на рисунке 5(d), состоит из подогреваемой платформы, которая легко адаптируется к предметному столику любого инвертированного микроскопа и может вмещать чашки Петри диаметром до 10 сантиметров. Прилипшие или взвешенные клетки наблюдаются через центральное (апертурное) отверстие нагревательной пластины. Хотя, клетки, находящиеся непосредственно над отверстием, не обогреваются, вследствие чего могут возникнуть проблемы с их выживаемостью в процессе длительных наблюдений, тем не менее, чашку можно легко поворачивать и, таким образом, помещать в апертуру соседние участки. Кроме того, с этим обогревателем можно использовать чашки Петри меньшего диаметра (35 мм или 60 мм), которые будут прогреваться более равномерно. На рисунке 5(e) представлен более сложный обогреватель для чашек Петри, в котором вместо круглого апертурного отверстия используется диагонально ориентированная щель. Этот инкубатор можно использовать для чашек Петри диаметром от 60 мм до 100 мм; имеется также меньший вариант для 35-миллиметровых чашек. Диагональная щель проходит от центра до периферийных участков чашки Петри, благодаря чему можно исследовать практически всю культуру, вращая чашку во время наблюдений. По соседству со щелью клетки содержатся при требуемой температуре, однако, те клетки, которые располагаются непосредственно над щелью, подвергаются флуктуациям температуры из-за наличия тепловых градиентов.

Представленный на рисунке 5(f), инкубатор с 6-ю лунками предназначен для установки на инвертированный микроскоп, и обеспечивает полный контроль над окружающей средой, позволяя получать изображения нескольких культур в течение длительного времени. Подсоединенная к внешнему термостату (ванне с регулируемой температурой), оборотная система водоснабжения позволяет регулировать температуру с точностью до десятых долей градуса (температура непрерывно контролируется путем сравнения с температурой в эталонной лунке). Отдельное устройство управления смешивает двуокись углерода с воздухом и непрерывно подает эту смесь в камеру инкубатора, а резервуар с водой внутри камеры позволяет поддерживать постоянную относительную влажность. Для этой камеры выпускается целый ряд принадлежностей, позволяющих использовать ее как с 35 мм чашками Петри, так и с многокамерными предметными стеклами (рисунок 3(f)), а также сменные переходники для установки от 12 до 96 многолуночных пластин и одиночных камер на базе покровного стекла. Эта высокотехнологичная система удобна для самых различных применений — от фармацевтических анализов до флуоресцентных наблюдений в широкопольной и конфокальной микроскопии.

Изолированные открытые чашки Петри и предметные стекла также могут поддерживаться при физиологических, либо близких к ним, температурах при помощи устройств, внешне и функционально похожих на фены (см. рисунок 6), или инкубаторные обогреватели для яиц. Хотя диапазон регулирования температуры и ограничивается несколькими десятыми долями градуса Цельсия, но даже при использовании пропорционального регулятора и дистанционного монитора для термодатчика, поток воздуха от фена направляется непосредственно на культуральную камеру и соседствующие с ней детали микроскопа (предметный столик, объектив и конденсор), что обеспечивает быструю реакцию на дрейф температуры. Более того, обеспечивается беспрепятственный доступ к образцу для применения лекарственных препаратов и замены среды. С другой стороны, по мере испарения из камеры влаги и утечки двуокиси углерода, выращиваемые в чашках Петри и обогреваемые фенами открытые культуры, подвергаются постепенному дрейфу pH и осмолярности. Это обстоятельство ограничивает применение фенов для открытых камер только краткосрочными наблюдениями, проводимыми в течение нескольких часов. В отличие от открытых систем, закрытые камеры (рассматриваются ниже) могут поддерживаться фенами в течение намного более длительных периодов времени. Еще один недостаток фенов состоит в том, что температура образца постоянно флуктуирует (пусть и в очень узком диапазоне), и в результате возникает дрейф фокусировки при каждом включении и выключении потока воздуха. Повысить общую стабильность условий культивирования и снизить уровень дрейфа можно, соединив принудительный вентиляторный воздухонагреватель с окружающим микроскоп климатроном (камерой искусственного климата). Для обогрева культур можно использовать также и инфракрасные лампы, однако им свойственны те же недостатки, что и фенам.

Представленные на рисунке 5 устройства обогрева, в большинстве своем, ограничивают области наблюдения живых клеток (зачастую, несколькими миллиметрами), требуя особого внимания к наличию зазора, достаточного для удобного поступательного перемещения объектива в пределах ограничений апертуры. Современные масляно- и водо-иммерсионные объективы имеют сравнительно большие размеры, очень малые рабочие расстояния, и могут быть настолько большими, что сталкиваются с нагревателями, имеющими чрезмерно толстые основания или установленными слишком высоко над предметным столиком микроскопа. Более того, малые апертуры многих обогревателей столиков могут серьезно ограничивать возможность перемещения объектива с масляной иммерсией вдоль стеклянной поверхности культуральной камеры. Выбирая обогреватель столика при исследованиях с визуализацией изображений живых клеток, следует сравнить размеры апертуры и объектива, чтобы иметь гарантированную возможность наблюдать достаточно большую площадь культуральной камеры.

78.jpg

Рис. 6. Инкубатор с феном

Некоторые из рассмотренных выше обогревателей для предметных стекол и чашек Петри (рисунок 5) по дополнительному заказу оснащаются изолирующими прокладками, с целью изоляции обогреваемой платформы от предметного столика. Эта мера призвана уменьшить рассеяние тепла через теплопроводящие металлические детали корпуса микроскопа. В качестве альтернативного средства минимизации тепловых потерь, нагревающие пластины могут устанавливаться на тонкий (1–2 мм) пластиковый или композитный изолирующий лист. Следует помнить, что предметный столик и корпус (штатив) микроскопа — это прекрасные проводники тепла, которые могут очень быстро превысить ограниченную нагревательную способность стандартных регуляторов и нагревательных пластин. Результатом, как правило, является постепенное понижение температуры (в особенности, вблизи апертуры), влияющее на жизнеспособность клеток и ставящее под сомнение результаты эксперимента. Еще один важный аспект, подлежащий обязательному учету, связан с реальной работой этих устройств. Хотя, благодаря точности пропорциональных регуляторов, обогреватели для чашек Петри и предметных стекол характеризуются превосходной точностью регулировки температуры (одна десятая градуса Цельсия), фактическая температура в области наблюдаемого образца часто отклоняется от заданной, что обусловлено градиентом, имеющим место в площади апертуры. По этой причине, для обеспечения жизнеспособности клеток во время длительных сеансов получения изображений, может возникнуть необходимость в использовании дополнительных нагревательных устройств (помимо простых обогревателей), например, обогревателей для объективов, или даже климатронов.

Практически все, рассмотренные в настоящем разделе, простые камеры для получения изображений вызывают определенные возмущения окружающей среды, поэтому, их использование следует ограничивать очень короткими исследованиями, как правило, от нескольких минут до, максимум, нескольких часов. Хотя специальные чашки Петри со стеклянным дном и пригодны для ряда экспериментов, камеры, изготовленные из полимеров (по сути, стандартные чашки Петри и полистироловые колбы для тканевых культур), страдают неоднородностью оптических поверхностей и вызывают деформации, что не позволяет использовать современные методы визуализации изображений, включая поляризацию и дифференциальныйинтерференционный контраст. Более того, толстостенные камеры (как пластмассовые, так и стеклянные) препятствуют использованию иммерсионных объективов с высокой числовой апертурой. И все же, самым отрицательным фактором при использовании простых камер, помимо недостаточной теплопередачи между устанавливаемыми на предметном столике обогревателями и камерой для получения изображений, является, пожалуй, постепенное повышение уровня pH и осмолярности, в результате медленного испарения среды. В совокупности, многочисленные недостатки простых культуральных камер не позволяют эффективно использовать такие камеры в серьезных экспериментах с визуализацией изображений. Поэтому, исследователям рекомендуется рассмотреть один из более совершенных вариантов, которые будут описаны далее. (См. Камеры для получения изображений живых клеток, часть 2)

Почему стоит работать с нами?

Комплексные поставки медицинского оборудования и мед. изделий
Прямые контракты с производителями - поставки оборудования на оптимальных условиях
Устойчивое финансовое положение позволяет участвовать в торгах любого объема
Широкая номенклатура товаров - более 3000 наименований товара на складе
Спонсорская поддержка наших партнеров и агентов
Богатый международный опыт поставок - торговые представительства в 50 странах мира

Связь со специалистом

Запросить цену

Заказать сервис

Отправить резюме

Подписаться на рассылку

Запросить коммерческое предложение